实验十五 脂质体的制备
一、实验目的
1. 掌握注入法制备脂质体的工艺。
2. 掌握脂质体包封率的测定方法。
二、实验原理
60年代初Banghan等发现磷脂分散在水中可形成多层囊，并证明每层囊均为双分子脂质膜组成且被水相隔开，称这种具有生物膜结构的囊为脂质体。197l年Ryman等人提出将脂质体作为药物载体，即将酶或药物包囊在脂质体中。近年来脂质体作为药物载体在传递给药系统中的研究有了迅速的发展。
脂质体系一种人工细胞膜，它具有封闭的球形结构，可使药物被保护在它的结构中，发挥定向作用。特别适于作为抗癌药物载体，以改善药物的治疗作用，降低毒副作用等。
脂质体系由磷脂为骨架膜材及附加剂组成。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂，如豆磷脂，卵磷脂等；合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱等。磷脂在水中能形成脂质体是由其结构决定的。磷脂具有两条较长的疏水烃链和一个亲水基团。当较多的磷脂加至水或水性溶液中，磷脂分子定向排列，其亲水基团面向两侧的水相，疏水的烃链彼此对向缔合形成双分子层，并进一步形成椭圆形或球状结构——脂质体。常用的附加剂为胆固醇，它也是两亲性物质，与磷脂混合使用，可制备稳定的脂质体，其作用是调节双分子层流动性，减低脂质体膜的通透性。其它附加剂有十八胺，磷脂酸等，这两种附加剂可改变脂质体表面电荷的性质。
脂质体可分为三类：小单室(层)脂质体，粒径在20～50nm，凡经超声波处理的脂质体混悬液，绝大部分为小单室脂质体；多室(层)脂质休，粒径约在400～1000nm；大单室脂质，粒径约为200～1000nm，用乙醚注入法制备的脂质体多属这—类。
脂质体包封率的测定包封率的定义可用下式表示：
包封率％ =（W总 - W游离）/ W总 x 100
式中W总——脂质体混悬液中总的药物量。W游离——未包入脂质体中的药物量。
影响脂质体包封率的因素有多种，如磷脂质的种类，组成比例，制备方法及介质的离子强度等。
包封率的测定方法有凝胶过滤法（常用凝胶为Sephadex G50、Gl00或Sephrous4B、6B）、超速离心法、透析法、超滤膜过滤法等，根据条件加以选择。
脂质体的制法有多种，可按药物性质或需要进行选择。薄膜分散法是一种经典的制备方法，它可形成多室脂质体，经超声处理，可得到小单室脂质体。此法特点是操作简便，但包封率较低。注入法，根据所用溶解磷脂质的溶剂，可分为乙醚注入法和乙醇注入法。乙醚注入法是将磷脂，胆固醇和脂溶性药物及抗氧剂等溶于适量的乙醚中，在搅拌下慢慢滴入50～65°C水性溶液中，蒸去乙醚，即可形成脂质体。此法适于实验室小量制备脂质体。乙醇注入法制备脂质体，脂质体混悬液一般可保留10％乙醇。反相蒸发法，是制备大单室脂质体的方法，此法包封率高。冷冻千燥法，适于在水中不稳定的药物制备脂质体。熔融法，此法适于制备多相脂质体，制得的脂质体稳定，可加热灭菌。本实验乙醚注入法制备安定脂质体，用薄膜分散法制备钙黄绿素脂质体。
三、仪器与试剂
注射器、50ml烧杯、磁力搅拌器、超声处理机、氮气、层析柱、20ml梨形瓶、Sephadex G50、安定、钙黄绿素、豆磷脂、胆固醇、生理盐水、乙醚等
四、实验内容与操作
1． 处方1
安定(100目) 0.025g
豆磷脂(精制) 0.2g
胆固醇 0.02g
生理盐水 加至10ml
处方2
钙黄绿素溶液（5mM） 1ml
豆磷脂 0.1g
胆固醇 0.01g
2. 操作
(1) 生理盐水的配制：称取注射用NaCl 9g，加蒸馏水适量使成1000ml。
(2)钙黄绿素(分子量666.51)溶液的配置：称取钙黄绿素0.3g，加入生理盐水适量使成100ml。
(3)磷脂、胆固醇乙醚溶液的配制：取处方量的豆磷脂、胆固醉溶于2ml的乙醚中，即得。
(4)乙醚注入法制备脂质体：取生理盐水约10m1于25ml烧杯中，置磁力搅拌器上，加热至50-60°C，将含磷脂、胆固醇的乙醚溶液慢慢滴加入生理盐水中，搅拌约20min，使乙醚完全挥发。加入安定粉，在继续搅拌2h，取下磁力搅拌器，镜检，即得。
(5)薄膜分散法制备脂质体：精密称定豆磷脂和胆固醇于20ml梨形瓶中，加入2ml乙醚使溶解，在晃动下用氮气或空气吹干乙醚，在梨形瓶的壁上有一层脂质薄膜形成，加入1ml钙黄绿素溶液，不断晃动，充分水化脂质薄膜，镜检，观察脂质体的形状和粒径大小；随后剧烈摇动梨形瓶，镜检，观察脂质体的形状和大小；水浴超声5min后，镜检，观察脂质体的形状和大小。
3．注意事项：
(1)生理盐水和钙黄绿素溶液可统一配置，由准备室教师完成。Sephadex G50的浸泡、装管和平衡由实验教师事先完成，用完后取出Sephadex G50，用水浸泡后冰箱中保存。
(2)溶解磷脂和胆固醇的乙醚溶液应澄清，否则需过滤除去杂质，
(3)乙醚液的注入，可用1m1的注射器或细滴管滴至生理盐水内部。须使产生的泡沫消失后再加第二滴。
(4)注入法实验过程中，温度可控制在50～60°C，操作中始终伴随搅拌，加入安定后搅拌的时间不得少于2h，因脂质体形成有个过程，温度、滴加速度和搅拌时间对脂质体的形成均有影响。
(5)薄膜分散法实验过程中，尽量使脂质在瓶壁上的薄膜平且薄，挥发尽乙醚。
4．质量检查与评价：
(1)脂质体的形态和粒度：在光学显微镜下(使用油镜或放大倍数接近的镜头)观察脂质体的形态，并测定最大和最多的脂质体粒径。
(2)异物：在显微镜下观察是否存在有色斑块、棒状结晶等。
(3)包封率测定：取3～5ml安定脂质体混悬液置超滤器上，加压过滤，收集滤液。取0．1ml滤液置25ml量瓶内，加0.5％硫酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；照分光光度法，在248nm波长处测定吸光度，按C16H18ClNO2的吸收系数(E1%1cm)为454计算未包入脂质体中安定的浓度。
另取lml安定脂质体混悬液置10m1量瓶中，加生理盐水稀释至刻度、播匀。取1m1上
述稀释液至25ml量瓶内，以下操作同未包封安定浓度的测定，计算出安定脂质体混悬液中安定浓度。计算脂质体包封率。
（4）层析柱分离脂质体与未包封的钙黄绿素（教师演示）：Sephadex G50适量，用生理盐水浸泡24h，装入层析柱中（250cm x 2cm），并用生理盐水平衡。加入制得的超声处理的脂质体混悬液0.5ml，用生理盐水洗脱，分管收集洗脱液。观察脂质体在层析柱上的洗脱条带，先洗脱下来的是脂质体部分，后洗脱下来的是未包封的钙黄绿素。
五、结果与讨论
1．绘制脂质体的形态图，说明脂质体的性状与乳滴有何不同？
2．记录镜下测定的脂质体的粒径。
最大粒径(μm)
最多粒径(μm)
3．包封率(％)
六、思考题
1.注入法制备脂质体成败的关键是什么?
2. 薄膜分散法实验过程中，脂质体混悬液的外观在震荡或超声后有什么变化？脂质体的粒径有什么变化？
3．制备脂质体时加入胆固醇的目的是什么？
